01  非生物風化

80℃黑暗中風化6個月后，LDPE塑料顆粒氧化變成橙黃色，通過FITR檢測發現出現羰基峰，分子量也減小。風化引起解聚，聚合物氧化鏈會斷裂。相比于原始的LDPE塑料，風化后的塑料產生大量溶解碳，如圖1所示。

圖1  原始和風化聚乙烯的非生物風化和碳浸出

02  在原始和風化PE中孵化時的生長

分別在含琥珀酸、原始LDPE 、風化LDPE和不添加碳源的培養基中接種Alcanivorax sp. 24，令人驚訝的是，從風化PE中浸出的約180 ppm碳（從圖1c推斷的數據）誘導的初始生長速率高于不穩定基質琥珀酸鹽。然而，隨著時間的推移，由于琥珀酸鹽條件下可獲得1200 ppm的碳，Alcanivorax sp.24實現了預期的更高細胞產量。無碳或原始LDPE顆粒的生長可以忽略不計（圖2b）。

Alcanivorax sp.24在存在原始PE和風化PE的情況下生長，獲得了塑料的同位素特征，證實該菌株不僅能夠吸收風化PE的滲濾液，而且能夠從原始PE中獲得碳。Alcanivorax 的同位素特征（δ¹³C）來自于與原始和風化的IAEA-CH-7 PE膜孵育七天的培養物（即檢查其同位素均勻性的材料，δ¹³C值為?32.15‰±0.05‰）。用琥珀酸和無碳源培養的細胞作為對照。以化石燃料為基礎的材料，如聚乙烯，因其¹³C耗盡而聞名，因此其δ¹³C值低于?30‰，而從C₄植物中獲得的琥珀酸鹽的¹³C含量更高，δ¹³C值在?13‰左右。在原始PE和風化PE中生長的Alcanivora 的同位素值與標準PE材料的同位素值幾乎相同，表明細胞獲得了塑料的同位素¹³C:¹²C比（圖2c）。正如預期的那樣，在琥珀酸鹽存在下生長的Alcanivorax 的δ¹³C特征不那么負（?16‰）。從沒有添加碳的培養物中提取的饑餓細胞似乎保留了它們最初使用的基質的同位素比例。

圖2  Alcanivorax sp.24在原始和風化PE上的生長

03  降低原始LDPE的質量和聚合物分子量分布

鑒于意外觀察到Alcanivorax 獲得了原始PE的同位素特征，我們進一步研究了該細菌是否能夠對塑料進行物理化學修飾。風化和非風化LDPE膜在Alcanivorax sp.24培養基中培養34天，然后測定質量變化（圖3）和聚合物總分子量（表1）。

表1  在Alcanivorax sp.24存在和不存在的情況下培養34天的原始和風化LDPE膜的聚合物分子量分布

有趣的是，Alcanivorax 使原始LDPE膜的中值質量減少了約0.9%，而奇怪的是，對照組（即未接種和死細胞對照組）的中值質量增加分別為約2.1%和約1.7%（圖3）。浸沒塑料的質量增加并不意外，可以通過材料內的膨脹水化和/或鹽沉積來解釋。風化LDPE膜的平均質量損失約為2.4%，與Alcanivorax 的存在無關（圖3）。該質量損失與根據風化聚乙烯釋放的溶解有機物（即約2%）計算的值一致，該值可能以微生物生物降解的現成低聚物的形式存在。Alcanivorax sp.24降低了原始LDPE的聚合物重量分布（表1）。細菌的存在將原始LDPE的分子量從122900減少到83500，將風化LDPE的分子量從24100減少到20600。原始LDPE的Mn、Mw和Mz的還原率分別為20.1%、32.0%和44.7%，風化LDPE的還原率分別為55.0%、14.7%和28.4%。這種廣泛的解聚作用再次表明Alcanivorax sp.24能夠對原始和風化的LDPE進行物理化學改性。因此，初級PE生物降解的分子機制值得進一步研究。

圖3  34天后，在Alcanivorax sp.24存在和不存在時的LDPE膜質量變化

04  通過蛋白質組分析法研究對PE存在的應答

通過蛋白質組學分析Alcanivorax sp.24對原始和風化LDPE膜存在的分子反應。分析包括浮游細胞和附著在PE上的生物膜，后者由于與基質直接接觸，有望提供更強的信號。這一全面的蛋白質組分析與Alcanivorax sp.24的蛋白質組分析相輔相成，Alcanivorax sp.24生長在中鏈和長鏈烷烴（C₁₆；戊烷，C₂₅；戊烷，C₅₀）以及短鏈和中鏈二羧酸（即琥珀酸，C₄；十六烷基二酸，C₁₆）上，所有基質都可能來自PE風化。Hakkarainen和Albertson（Hakkarainen和Albertson, 2004）發現了200多種非生物PE氧化產生的脂肪族降解產物，Eyheraguibel及其同事（Eyheraguibel等人，2017）最近描述了1320種高度氧化的低聚物，即烷烴、烯烴、酮、醛、醇、羧酸和二羧酸、內酯、酮酸和酯類。在這些脂肪族基質中，羧酸最穩定，因此在長時間的風化過程中容易積累，而其他產物，如醛、酮和醇，則進一步氧化為羧酸。條件之間的總體比較顯示，從不穩定基質到穩定基質存在梯度，即琥珀酸是最不穩定的基質，其次是烷烴C₁₆和C₂₅以及十六烷基二酸。在Alcanivorax 的更頑固的底物中，我們觀察到原始的PE和長烷烴C₅₀，其次是風化的PE（其中浮游生物和生物膜生長的細胞的蛋白質組非常緊密地分組）。在原始PE作為碳源的情況下，觀察到浮游生物和生物膜生長的細胞之間有更強的分化，這表明直接附著在PE上的細胞可能更容易接觸到這種頑固性基質（圖4）。因此，PE作為異養細菌細胞碳源的可及性似乎受到PE熱氧化以及Alcanivorax 黏附在材料表面的強烈介導。

圖4  不同處理下生長的Alcanivorax sp.24產生的蛋白質組數據的主成分分析

所有處理與琥珀酸鹽（對照）生長之間的比較蛋白質組學使我們能夠確定Alcanivorax 用于特異分解中鏈和長鏈烷烴以及中鏈二羧酸（即十六烷基二酸）的細胞過程，并將其與菌株在原始和風化PE中生長時的細胞反應進行比較。有趣的是，當在中鏈和長鏈烷烴或十六烷基二酸存在下生長時，一些蛋白質顯示出更高的豐度，但這些蛋白質在PE處理中均上調（圖5），證實了Alcanivorax 編碼的代謝多功能性，以分解PE鏈氧化和斷裂產生的脂肪族化合物的復雜混合物。

05  烷烴氧化

羥基化是烷烴同化的第一步。短鏈和中鏈烷烴被烷烴單加氧酶AlkB末端羥基化。Alcanivorax sp.24編碼三種AlkB酶，即使在存在原始PE的情況下，其在大多數烷烴和PE處理中的表達也顯著增加。長鏈烷烴（例如C₅₀）的同化目前尚不清楚，有研究者假設長鏈烷烴的氧化可能在底物亞末端羥基化后完成，然后通過Baeyer-Villiger單加氧酶AlmA將亞末端羥基化烷烴轉化為酯，再由酯酶進一步水解。有趣的是，AlmA在所有PE處理中表現出最強的增長，這可能是PE生成長鏈烷烴的結果。正如所料，在十六烷基二酸處理中未觀察到AlmA和AlkB酶豐度的增加，這表明這些途徑受到Alcanivorax sp.24中烷烴的存在的嚴格調控。

圖5  Alcanivorax sp.24用于攝取和降解脂肪族底物的代謝途徑模型

06  脂肪酸降解模型

羥基化烷烴進一步氧化為脂肪酸，并通過β-氧化途徑降解。圖5顯示大量脂肪酸降解酶分配給某些底物組的嘗試：以脂肪酸形式漏斗狀排列的中型和大型烷烴，以及中型二羧酸。有趣的是，這些酶在PE處理中均上調，另外一組酶僅在塑料存在時上調，作者認為它們參與降解更復雜的脂肪族化合物，例如不飽和和亞末端氧化以及支鏈、奇數和大脂肪酸。因此，PE降解產生的產物最終轉化為醋酸鹽，并進入TCA循環，用于碳同化和能量生成。

07  初級PE鏈斷裂

與短鏈和中鏈烷烴不同，長鏈和超長鏈烷烴（如PE中的烷烴）的生物結合似乎是不現實的，聚合物鏈斷裂是跨生物膜運輸所必需的。雖然形成PE主鏈的C-C鍵高度穩定且無反應，但PE氧化會產生較弱的酶斷鏈位點。脂肪族化合物的存在誘導了Alcanivorax sp. 24中脂肪酶和水解酶的上調。雖然大多數水解酶（即ALC24_0035、1429、1581、2299和4209）被預測為細胞質，因此可能在進口低聚物的生物降解中發揮作用，但酶ALC24_1162、2550和3988可能分泌到周質或外膜，在那里它們可以水解氧化的PE鏈，降低其分子量并促進其生物同化（圖5）。

08  產生氧化LDPE膜表面的細胞外活性氧

眾所周知，海洋微生物可產生細胞外活性氧，尤其是超氧化物（推測是引發PE鏈斷裂和降解的主要途徑）。因此，我們測量了Alcanivorax sp.24在不同底物存在下生長14天后產生的細胞外活性氧（圖6a）。有趣的是，雖然在大多數情況下，在最初24小時的培養過程中觀察到超氧物生成的峰值，但在整個兩周的培養過程中，原始LDPE誘導Alcanivorax 產生的ROS較低但延長了很多（圖6a）。經風化PE培養后，超氧物的生成水平可以忽略不計，這可能是由于細菌產生的ROS較低，或由于塑料滲濾液可能具有猝滅作用，即與超氧物快速反應，不允許其氧化熒光素報告物。

圖6  Alcanivorax sp.24培養物中ROS的產生和LDPE膜表面氧化

在用Alcanivorax 培養的原始LDPE膜中檢測到氧化峰（圖6b上的綠色箭頭）表明，細菌產生的活性氧實際上可能影響聚合物的物理化學。該氧化峰發生在熱氧化非生物誘導羰基形成的相同波數處。

09  總 結

總之，我們的數據為PE生物降解提供了關鍵的新見解。Alcanivorax sp.24在分解PE降解產生的脂肪族基質的復雜混合物方面表現出令人印象深刻的代謝潛力，當細菌暴露于風化和原始PE時觀察到這一點。這種代謝途徑的誘導以及塑料同位素特征的獲得表明，細菌可以有效地利用從這種材料中滲出的少量基質，或其本身可以引發原始PE的鏈斷裂，即，如所測試的原始和風化LDPE材料的質量損失和廣泛解聚所示，原始PE的主鏈斷裂可能通過細胞外活性氧的產生和高分子量PE聚合物的非特異性鏈內氧化發生。需說明的是該研究是在最佳的實驗室條件下進行的純菌培養，無法確定復雜生物和換幾個是否會對碳氫化合物的降解產生影響，還需進一步的研究證實。